Razlika med RT PCR in QPCR

Ključna razlika - RT PCR v primerjavi z QPCR
 

Verižna reakcija polimeraze je tehnika, ki se uporablja za pomnoževanje določenega območja DNK in vitro. Zaradi izuma te tehnike s strani Karyja Mullisa leta 1983 so znanstveniki lahko v raziskovalne namene naredili od tisoč do milijonov kopij posebnih fragmentov DNK. Trenutno je postala običajna in redno izvajana tehnika v kliničnih in raziskovalnih laboratorijih za najrazličnejše aplikacije. Obstajajo različice tradicionalne tehnike PCR, kot so RT PCR, ugnezdeni PCR, multipleksni PCR, Q PCR, RT - QPCR itd. RT PCR in Q PCR sta dve pomembni različici PCR. Ključna razlika med RT PCR in Q PCR je v tem RT PCR se uporablja za zaznavanje izražanja genov z ustvarjanjemkomplementarna DNK (cDNA) prepisov iz RNA medtem Q PCR se uporablja za količinsko merjenje izdelkov PCR v realnem času s fluorescenčnimi barvili.

VSEBINA
1. Pregled in ključne razlike
2. Kaj je RT PCR
3. Kaj je QPCR
4. Vzporedna primerjava - RT PCR proti QPCR
5. Povzetek

Kaj je RT PCR?

Verižna reakcija z reverzno transkripcijo polimeraza (RT PCR) je različica PCR, ki se uporablja za zaznavanje izražanja RNA. Je zelo pomembna metoda za odkrivanje izražanja mRNA v tkivih. RT PCR se uporablja, kadar je izhodni material vzorca RNA. V RT PCR se šablonska mRNA najprej pretvori v komplementarno DNA. Ta korak katalizira encimska reverzna transkriptaza in postopek je znan kot povratna transkripcija. Drugič, za pomnoževanje na novo sintetizirano cDNA se uporablja tradicionalni PCR.

RT PCR je zelo občutljiva tehnika, ki zahteva relativno majhno količino vzorca RNA. RT PCR se običajno uporablja pri diagnozi in količinski opredelitvi vrst RNA, zlasti virusov RNA, kot sta virus humane imunske pomanjkljivosti in virus hepatitisa C.

Slika 01: RTR tehnika

Kaj je QPCR?

Kvantitativni PCR (QPCR) je različica PCR, ki se uporablja za količinsko merjenje izdelkov PCR. Omenjajo ga tudi kot verižna reakcija s polimerazo v realnem času, saj meri ojačanje v realnem času s pomočjo PCR naprave v realnem času. Je primerna metoda za določanje količine ciljne sekvence ali gena, ki je prisoten v vzorcu. Zanimivost QPCR je, da združuje tako ojačitev kot resnično količinsko določitev v en korak. Zato je treba s tehniko QPCR odpraviti potrebo po gelski elektroforezi pri odkrivanju. QPCR uporablja fluorescentna barvila za označevanje izdelkov PCR med reakcijami PCR, ki sčasoma vodijo do neposredne količinske določitve. Ko se PCR izdelki kopičijo, se naberejo tudi fluorescenčni signali in jih bo meril stroj v realnem času. QPCR lahko kombiniramo z RT PCR. Znan je kot RT - QPCR ali QRT - PCR in velja za najmočnejšo, občutljivo in količinsko metodo za odkrivanje ravni RNA v celicah ali tkivih..

SYBR Green in Taqman sta dve metodi, ki se uporabljata za zaznavanje ali opazovanje procesa amplifikacije PCR v realnem času. SYBR Green metoda se izvaja s fluorescentnim barvilom, imenovanim SYBR green, in zazna ojačanje z vezavo barvila, da ustvari dvojno verižno DNK. Taqman se izvaja s pomočjo sond z dvojno oznako in zazna ojačanje z degradacijo sonde s Taq polimerazo in sproščanjem fluorofore, kot je prikazano na sliki 02. Obe metodi spremljata napredek postopka amplifikacije in poročata o količini izdelka v realnem času.

PCR v realnem času ima široko paleto aplikacij, kot so kvantifikacija genske ekspresije, analiza mikroRNK in nekodirajoča RNA, genotipizacija SNP, odkrivanje različic številčnih kopij, odkrivanje redkih mutacij, odkrivanje gensko spremenjenih organizmov, odkrivanje povzročiteljev okužb itd..

Slika 02: Kvantitativna tehnika PCR

Kakšna je razlika med RT PCR in QPCR?

RT PCR vs QPCR
RT PCR je tehnika, ki se uporablja za zaznavanje genske ekspresije z amplifikacijo.	QPCR je tehnika, ki amplificira DNK in količinsko opredeli izdelke PCR v realnem času.
Vključevanje encima za reverzno transkriptazo
Encimska obratna transkriptaza se uporablja za RT PCR.	Encimska obratna transkriptaza se za QPCR ne uporablja.
Uporaba fluorescentno označenih molekul
Za RT PCR se ne uporabljajo fluorescentno označena barvila ali sonde.	Za QPCR se uporabljajo fluorescentno označena barvila ali sonde.
Kvantifikacija izdelka PCR
Razen PCRR, če ni skupaj s QPCR, izdelka PCR ne ovrednoti.	QPCR količinsko meri izdelek PCR.
Začetni material
Izhodiščni material je mRNA.	Izhodiščni material je DNK.
Sinteza cDNA
Komplementarna DNA nastaja med RT PCR.	Komplementarna DNA se ne proizvaja med QPCR.

Povzetek - RT PCR proti QPCR

RT PCR in QPCR sta dve različici tradicionalnega PCR. RT PCR tehnika se izvaja za vzorce mRNA, poganja pa jo z obratno transkripcijo in proizvodnjo cDNA. QPCR se uporablja za količinsko opredelitev izdelkov PCR v toplotnih ciklih PCR v realnem času z uporabo fluorescentnih barvil ali označenih sond. V QPCR je količina izdelka PCR predstavljena z oddajanimi fluorescentnimi signali vzorca. RT PCR se pogosto uporablja kot proces amplifikacije, medtem ko se QPCR običajno uporablja kot postopek določanja. To je razlika med RT PCR in QPCR.

Reference:
1. Deepak, SA, KR Kottapalli, R. Rakwal, G. Oros, KS Rangappa, H. Iwahashi, Y. Masuo in GK Agrawal. "PCR v realnem času: revolucionarna analiza odkrivanja in izražanja genov." Trenutna genomika. Bentham Science Publishers Ltd., junij 2007. Splet. 03. april 2017
2. Zeka, Fjoralba, Katrien Vanderheyden, Els De Smet, Claude A. Cuvelier, Pieter Mestdagh in Jo Vandesompele. "Analiza genske ekspresije vzorcev FFPE na podlagi naravne in občutljive RT-qPCR." Novice o naravi Nature Publishing Group, 22. februar 2016. Splet. 03. april 2017
3. Overbergh, L., A. Giulietti, D. Valckx, B. Decallonne, R. Bouillon in C. Mathieu. "Uporaba PCR v realnem času povratne transkriptaze za količinsko določitev ekspresije genov citokinov." Journal of Biomolecular Techniques: JBT. Združenje biomolekularnih virov, mar. 2003. Splet. 03. april 2017

Vljudnost slik:
1. "Taqman" Uporabnik: Braindamaged - Lastno delo prvotnega nalagalca (Public Domain) prek Commons Wikimedia
2. "Verižna reakcija z obratno transkripcijo" polimeraza "Jpark623 - Lastno delo (CC BY-SA 3.0) prek Commons Wikimedia