Razlika med PCR in DNA sekvenciranjem

Ključna razlika - PCR vs zaporedje DNK
 

PCR in zaporedje DNK sta dve pomembni tehniki molekularne biologije. Verižna reakcija polimeraze (PCR) je postopek, ki ustvari veliko število kopij fragmenta DNA. Sekvenciranje DNK je tehnika, ki ima za posledico natančen vrstni red nukleotidov danega fragmenta DNK. To je ključna razlika med zaporedji PCR in DNK. PCR je eden glavnih korakov v sekvenci DNA.

VSEBINA
1. Pregled in ključne razlike
2. Kaj je PCR
3. Kaj je sekvenca DNK
4. Primerjava ob strani - PCR vs DNA zaporedje
5. Povzetek

Kaj je PCR?

Verižna reakcija polimeraze (PCR) je tehnika amplifikacije DNA, ki se uporablja v molekularni biologiji. Iz posameznega fragmenta DNK nastane na tisoče do milijone kopij. To metodo je razvil Kary Mullis leta 1983. Pri tej tehniki fragment DNK, ki ga je treba amplificirati, služi kot predloga in encim DNA polimeraza doda dopolnilne nukleotide v osnovni premaz, ki je na voljo v PCR mešanici. Na koncu reakcije PCR se sintetizira veliko kopij vzorčne DNK.

Obstajajo različne sestavine PCR mešanice, vključno z DNA, DNK polimerazo (Taq polimeraza), prajmeri (sprednji in povratni primerji), nukleotidi (gradniki DNK) in pufer. PCR se zgodi znotraj PCR naprave, v stroj naj bo vstavljena pravilna mešanica PCR in zagon pravilnega programa. Ta tehnika omogoča izdelavo tisoč do milijonov izvodov določenega odseka DNK iz zelo majhne količine DNK.

PCR reakcije potekajo ciklično, da nastane vidna količina PCR produktov na gelu. V reakciji PCR so trije glavni koraki, in sicer denaturacija, žarjenje osnovnega prahu in podaljševanje pramenov, kot je prikazano na sliki 01. Ti trije koraki se izvajajo pri treh različnih temperaturah. DNK obstajajo v dvojni verigi z vodikovimi vezmi med komplementarnimi bazami. Pred implikacijo je treba dvojno verižno DNK ločiti drug od drugega. To se naredi z dajanjem visoke temperature. Pri visoki temperaturi dvotirano denatura DNA v enojne niti. Nato se mora temeljni premaz približati stranskim koncem določenega fragmenta ali gena DNK. Primer je kratek del enoverižne DNK, ki dopolnjuje ciljno zaporedje. Sprednji in povratni prajmerji sežigajo s komplementarnimi osnovami na stranskih koncih denaturiranega vzorca DNK pri temperaturi žarjenja. Temni premazi morajo biti toplotno odporni. Ko se začetki odstranijo z vzorčno DNK, encim taq polimeraza začne sintezo novih niti z dodajanjem nukleotidov, ki so komplementarni ciljni DNK. Taq polimeraza je toplotno stabilen encim, izoliran iz termofilne bakterije, imenovane Thermus aquaticus. Pufer PCR vzdržuje optimalne pogoje za delovanje taq polimeraze. Te tri stopnje reakcij PCR se ponavljajo, da nastane potrebna količina izdelka PCR. Po vsaki reakciji s PCR se število kopij DNK podvoji. Zato lahko v PCR opazimo eksponentno ojačanje. Izdelke PCR lahko opazimo z uporabo elektroforeze z geli in jih lahko prečistimo za nadaljnje študije.

Slika 01: Glavni koraki reakcije PCR

PCR je dragoceno orodje v medicinskih in bioloških raziskavah. PCR ima v forenzični znanosti posebno vrednost, saj lahko poveča DNK za študije iz drobnih vzorcev kriminalistov in naredi forenzične DNK profile. PCR se pogosto uporablja na številnih področjih molekularne biologije, vključno z genotipizacijo, kloniranjem genov, odkrivanjem mutacij, zaporedjem DNK, mikroraščitvami DNK in testiranjem očetovstva itd..

Slika 02: Verižna reakcija polimeraze

Kaj je sekvenca DNK?

Zaporedje DNK je določitev natančnega vrstnega reda nukleotidov - adenina, gvanina, citozina in timina v določenem fragmentu DNK. Genske informacije so shranjene v zaporedjih DNK z uporabo pravilnega vrstnega reda nukleotidov. Zato je iskanje natančnega vrstnega reda nukleotidov v fragmentu DNK zelo pomembno, da vemo o zgradbi in funkciji genov.

Protokol sekvenciranja DNK vključuje različne procese. Prvi korak je izolacija zainteresirane DNK ali genomske DNA organizma. Z uporabo PCR (kot je opisano zgoraj) je treba želeno območje DNK okrepiti. Ojačani PCR izdelek je treba ločiti z elektroforezo gela in očistiti. Ojačani fragmenti služijo kot predloge za zaporedje. Zaporedje se lahko opravi po Sangerjevem zaporedju ali po metodi sekvenciranja z veliko prepustnostjo. Za varnejše zaporedje je potrebna kapilarna elektroforeza nastalih fragmentov DNK. Določitev pravilnega vrstnega reda nukleotidov je mogoče opraviti z ročnim branjem avtoradiografov ali z uporabo avtomatiziranih sekvence DNA.

Zaporedje genov je prispevalo k projektu človeški genom in olajšalo kartiranje človeškega genoma leta 2003. V forenziki je sekvenciranje DNK omogočilo identifikacijo posameznikov, ki prikazujejo edinstvene sekvence DNK in identificirajo kriminalce. V medicini lahko zaporedje DNK uporabimo za odkrivanje genov, ki so odgovorni za genetske in druge bolezni, iskanje genov z napako in njihovo nadomestitev s pravilnimi geni. Podatki o zaporedju DNK nekaterih mikroorganizmov se v kmetijstvu uporabljajo za proizvodnjo transgenih posevkov z ekonomsko želenimi lastnostmi.

Slika 03: Zaporedje DNK

Kakšna je razlika med PCR in DNK sekvenciranjem?

PCR vs DN-zaporedje
PCR postopek ustvari na tisoče do milijone kopij zainteresiranega fragmenta DNK.	Sekvenciranje DNK je postopek določanja natančnega vrstnega reda nukleotidov v danem fragmentu DNK.
Izid
PCR ustvari na tisoče do milijone kopij določenega fragmenta DNK	Rezultat je pravilen vrstni red baz v določenem fragmentu DNK.
Vključenost DDNTP
PCR ne zahteva DDNTP. Uporablja dNTP.	Za sekvenco DNK so potrebna DDNTPs, da prekinejo tvorbo pramenov.

Povzetek - PCR vs DNA zaporedje

PCR in DNK zaporedja so zelo pomembna orodja na številnih področjih molekularne biologije. Amplifikacija fragmentov DNA poteka s tehniko PCR, medtem ko je pravilni vrstni red nukleotidov fragmenta DNA določen s sekvenciranjem DNK. To je razlika med zaporedjem PCR in DNA.

Referenca:
1. "Verižna reakcija polimeraze (PCR)." Nacionalni center za informacije o biotehnologiji. Ameriška nacionalna medicinska knjižnica, n.d. Splet. 21. februar 2017.
2. Shendure, Jay in Hanlee Ji. "DNK naslednje generacije zaporedja." Novice o naravi Nature Publishing Group, 9. oktober 2008. Splet. 21. februar 2017

Vljudnost slik:
1. "PCR koraki" avtorja Tinojasontran - Lastno delo (Public Domain) prek Commons Wikimedia
2. "Verižna reakcija s polimerazo" Enzoklop - Lastno delo (CC BY-SA 3.0) prek Commons Wikimedia
3. "Zaporedje DNK" avtorja Sjef - Lastno delo (Public Domain) prek Commons Wikimedia