Razlika med NGS in Sanger Sequcking

Ključna razlika - NGS vs Sanger Sequiting
 

Naslednja generacija sekvenciranja (NGS) in Sanger Sequiting sta dve vrsti nukleotidnih zaporednih tehnik, ki sta se razvili skozi čas. Metoda Sanger Sequiting se je množično uporabljala vrsto let, NGS pa jo je zaradi svojih prednosti v zadnjem času zamenjal. Ključna razlika med NGS in Sanger Sequencing je v tem NGS deluje na principu zaporednega zaporedja milijonov sekvenc hkrati s sistemom sekvenciranja, medtem ko Sanger Sequaching deluje na glavni verigi prekinitve verige zaradi selektivne vključitve dideoksinukleotidov z encimom DNK polimeraza med podvajanjem DNK in ločevanjem fragmentov s kapilaro elektroforeza.

VSEBINA
1. Pregled in ključne razlike
2. Kaj je nukleotidno sekvenciranje
3. Kaj je NGS
4. Kaj je Sanger Sequiting
5. Primerjava ob strani - NGS proti Sanger Sequcking
6. Povzetek

Kaj je nukleotidno sekvenciranje?

Genske informacije so shranjene v nukleotidnih zaporedjih DNK ali RNK organizma. Postopek določanja pravilnega vrstnega reda nukleotidov (z uporabo štirih baz) v danem fragmentu (v genu, grozdu genov, kromosomu in popolnem genomu) je znan kot nukleotidno zaporedje. V genskih študijah, forenzičnih študijah, virologiji, biološki sistematiki, medicinski diagnostiki, biotehnologiji in na mnogih drugih področjih je zelo pomembno analizirati strukturo in delovanje genov. Obstajajo različne vrste zaporednih metod, ki so jih razvili znanstveniki. Med njimi, Varno zaporedje razvil Frederick Sanger leta 1977, se je dolgo uporabljal in populariziral Naslednja generacija zamenjal.

Kaj je NGS?

Naslednja generacija sekvenciranja (NGS) je izraz, ki se uporablja za označevanje sodobnih postopkov sekvenciranja z visoko hitrostjo. Opisuje številne različne sodobne tehnologije zaporedja, ki so spremenile genomske študije in molekularno biologijo. Te tehnike so sekvenciranje Illumina, zaporedje Roche 454, sekvenca ionskega protona in zaporedje SOLiD (sekvenciranje z Oligo Ligation Detection). NGS sistemi so hitrejši in cenejši. V sistemih NGS se uporabljajo štiri glavne metode zaporedja DNK; pirokvencioniranje, sekvenciranje s sintezo, sekvenciranje z ligacijo in ionsko polprevodniško sekvenciranje. Veliko število pramenov DNK ali RNK (v milijonih) je mogoče zaporedno sekvencirati. Omogoča sekvenciranje celotnega genoma organizmov v kratkem časovnem obdobju, za razliko od Sangerjevega sekvenciranja, ki traja več časa.

NGS ima veliko prednosti pred običajnim postopkom Sanger. To je hiter, natančnejši in stroškovno učinkovitejši postopek, ki ga je mogoče izvesti z majhno velikostjo vzorca. NGS se lahko uporablja v metagenomskih študijah, pri odkrivanju sprememb znotraj posameznega genoma zaradi vstavitev in delecij itd. In pri analizi genske ekspresije.

Slika_1: Razvoj v sekvenciranju NGS

Kaj je Sanger Sequiting?

Sanger Sequencing je metoda zaporedja, ki sta jo leta 1977 razvila Frederick Sanger in njegovi sodelavci, da bi določila natančen vrstni red nukleotidov danega fragmenta DNK. Znan je tudi kot veriženje zaključka verige ali Dideoksi zaporedje. Načelo delovanja te metode je prekinitev sinteze pramenov s selektivno vključitvijo verižno zaključenih dideoksinukleotidov (ddNTP), kot so ddGTP, ddCTP, ddATP in ddTTP z polimerazo DNA med podvajanjem DNK. Normalni nukleotidi imajo 3 'OH skupine za tvorbo fosfodiesterske vezi med sosednjimi nukleotidi za nadaljevanje tvorbe pramenov. Vendar pa DDNTP nima te 3 'OH skupine in ne morejo tvoriti fosfodiesterskih vezi med nukleotidi. Tako se raztezanje verige preneha.

Pri tej metodi enojna veriga DNA, ki jo je treba sekvencirati, služi kot predloga za predlogo in vitro Sinteza DNK. Druge zahteve so oligonukleotidni temeljni premaz, prekurzorji deoksinukleotida in encim DNA polimeraza. Ko so znani robovi končnega fragmenta znani, se lahko primerji zlahka oblikujejo za podvajanje DNK. Štiri ločene reakcije sinteze DNA potekajo v štirih ločenih epruvetah. Vsaka cev ima ločene ddNTP, skupaj z drugimi zahtevami. Iz posameznega nukleotida dodamo mešanico dNTP in ddNTP. Prav tako se v štirih epruvetah s štirimi mešanicami izvedejo štiri ločene reakcije. Po reakcijah se izvede odkrivanje fragmentov DNK in pretvorba vzorca fragmenta v informacije o zaporedju. Rezultirajoči fragmenti DNK so toplotno denaturirani in ločeni z gel elektroforezo. Če uporabimo radioaktivne nukleotide, lahko vzorec vezanja v poliakrilamidnem gelu vizualiziramo z avtoradiografijo. Ko ta metoda uporablja fluorescentno označene dideoksinukleotide, jih je mogoče omiliti na odčitanem gelu in preiti skozi laserski žarek, da ga fluorescenčni detektor zazna. Da bi se izognili napakam, ki se lahko pojavijo, ko zapored bere oko in ročno vnese v računalnik, se je ta metoda razvila v uporabo avtomatiziranega sekvencera skupaj z računalnikom.

To je metoda, ki se uporablja za sekvenciranje DNK iz projekta Human Genome. Ta metoda je še vedno v uporabi z naprednimi spremembami, saj daje natančne informacije o zaporedju, čeprav je drag in počasen postopek.

Slika_2: Zaščitno zaporedje

Kakšna je razlika med NGS in Sanger Sequcking?

NGS vs Sanger Sequiting
Naslednja generacija zaporedja (NGS) se nanaša na sodobne postopke sekvenciranja z visoko prepustnostjo. Opisuje številne različne sodobne tehnologije zaporedja	Sanger Sequisting je metoda zaporedja, ki jo je razvil Frederick Sanger za določitev natančnega vrstnega reda nukleotidov danega fragmenta DNK.
Stroškovna učinkovitost
NGS je cenejši postopek, saj zmanjšuje čas, človeško moč in kemikalije.	To je drag postopek, ker je potreben čas, človeška moč in več kemikalij.
Hitrost
To je hitrejše, saj se tako kemično odkrivanje kot tudi odkrivanje signala mnogih pramenov odvijata vzporedno.	To je zamudno, saj se kemično zaznavanje in odkrivanje signala zgodita kot dva ločena procesa in naenkrat lahko berejo samo na pramenih.
Zanesljivost
NGS je zanesljiv.	Zanesljivo zaporedje je manj zanesljivo
Velikost vzorca
NGS zahteva manj količine DNK.	Ta metoda potrebuje veliko količino DNK predloge.
DNK baze na zaporednem fragmentu
Število baz DNK na zaporednem fragmentu je manjše od Sangerjeve metode	Ustvarjanje zaporedij je daljše od sekvenc NGS.

Povzetek - NGS vs Sanger Sequisting

NGS in Sanger Sequisting sta tehnika nukleotidnega zaporedja, ki se široko uporablja v molekularni biologiji. Sanger sekvenciranje je zgodnja metoda sekvenciranja, ki jo je nadomestil NGS. Glavna razlika med NGS in Sanger Sequencing je, da je NGS hiter, natančnejši in stroškovno učinkovitejši postopek od Sangerjevega zaporedja. Obe tehniki sta povzročili velike izbruhe na področju genetike in biotehnologije.

Referenca:
1. Nowrousian, Minou. „Tehnike sekvenciranja naslednje generacije za evkariontske mikroorganizme: rešitve bioloških težav, ki temeljijo na sekvenciranju.“ Evkariontska celica. Ameriško društvo za mikrobiologijo, september 2010. Splet. 18. februar 2017
2. Sanger, F., S. Nicklen in A. R. Coulson. "Sekvenciranje DNK z zaviralci verige." Zbornik Nacionalne akademije znanosti 74.12 (1977): 5463-467. Splet.
3. Liu, Lin, Yinhu Li, Siliang Li, Ni Hu, Yimin He, Ray Pong, Danni Lin, Lihua Lu in Maggie Law. "Primerjava sistemov za zaporedje naslednje generacije." Časopis za biomedicino in biotehnologijo 2012 (2012): 1-11. Splet.

Vljudnost slik:
"Sanger-sequiting" Estevezj - Lastno delo (CC BY-SA 3.0) prek Commons Wikimedia 
"Razvoj v nadaljevanju nove generacije" Nederbragt, Lex (2012) - (CC BY 3.0) prek Commons Wikimedia