Razlika med kloniranjem in subkloniranjem

Ključna razlika - Kloniranje proti subkloniranju
 

Kloniranje in subkloniranje sta molekularni biološki postopki, ki ustvarjajo genetsko identične celice ali organizme, ki vsebujejo DNK ali gen, ki sta zanimiva. Kloniranje je tehnika, ki vključuje vstavljanje zainteresiranega gena ali DNK v vektor, njegovo kopiranje v gostiteljski bakteriji in proizvodnjo celic ali organizmov, ki so natančne kopije genske sestave. Subkloniranje je tehnika, ki vključuje vstavljanje gena, ki nas zanima, ki je že vstavljen v vektor, v sekundarni vektor, njegovo kopiranje v gostiteljski bakteriji in izdelavo gensko identičnih kopij celic ali organizmov. Ključna razlika med kloniranjem in subkloniranjem je v tem, pri kloniranju se zanimivi gen, ko se enkrat veže v vektor, nadaljuje s postopkom kloniranja, medtem ko se v subkloniranju že kloniran zanimiv gen loči od nadrejenega vektorja in ga vstavi spet v prejemni vektor in nadaljuje postopek.

VSEBINA
1. Pregled in ključne razlike
2. Kaj je kloniranje
3. Kaj je subkloniranje
4. Primerjava ob strani - Kloniranje proti subkloniranju
5. Povzetek

Kaj je kloniranje?

Kloniranje je postopek, ki proizvaja gensko enake organizme ali celice. V naravi se kloniranje zgodi s pomočjo aseksualne reprodukcije. Kadar ne pride do genetske rekombinacije ali spremembe, hčerinske celice dobijo enako gensko sestavo starša. Prokariontski in evkariontski organizmi ustvarjajo klone z binarno cepitvijo, brstičenjem, mitozo itd. V molekularni biologiji so kloniranje genov ali določenih fragmentov DNK priljubljena metoda za preučevanje strukture in funkcije določenega odseka DNK.

Glavni cilj molekularnega kloniranja je narediti milijone kopij gensko identičnih celic ali organizmov, ki vsebujejo zanimiv fragment DNK (večinoma geni). Ustvari organizme z natančnimi genetskimi kopijami drugega. V molekularnih študijah se klonirajo specifično geni, da se pridobijo strukturne in funkcionalne informacije in za sekvenciranje DNA. Tudi za proizvodnjo specifičnih beljakovin ali izdelkov v velikem obsegu se pogosto uporablja kloniranje.

Postopek kloniranja

Osnovni koraki postopka kloniranja so naslednji.

1. Identifikacija in izolacija gena, ki nas zanima. (Amplifikacija gena, ki nas zanima, s PCR).
2. Restriktivna prebava gena, ki vas zanima (Restriction endonuclease cut gen).
3. Restriktivna prebava vektorske DNK. (Vektorski DNK se razreže tudi z enako restrikcijsko endonukleazo).
4. Vstavljanje gena v vektor in tvorba rekombinantne molekule.
5. Transformacija rekombinantnega vektorja v gostiteljsko bakterijo.
6. Izolacija in identifikacija transformiranih bakterij (plazmidni vektor mora vsebovati izbirni gen, najpogosteje gen za odpornost na antibiotike za presejanje transformiranih bakterij).
7. Rekombinantna ekspresija genov v gostitelju.

Slika_01: Postopek kloniranja

Kaj je subkloniranje?

Subkloniranje je postopek premika gena, ki nas zanima, z enega vektorja na drugega, da bi videli izražanje gena za pridobitev želene funkcionalnosti gena. Pri tej metodi sta vključena dva vektorja; in sicer nadrejeni in ciljni vektor. Klonirani vložki se v subkloniranju spet premaknejo v drugi vektor. Cilj prenosa gena s prvega na drugi vektor je pridobiti nekaj, česar prvi vektor ne bi mogel storiti, ali ločiti gena znotraj že kloniranega fragmenta DNK in ga sam izraziti. Restriktivni encimi se v tem postopku uporabljajo na začetku.

Postopek subkloniranja

Osnovni koraki subkloniranja so naslednji.

1. S pomočjo restrikcijskih endonuklez ločimo DNK, ki nas zanima, v donorski plazmid (matični vektor).
2. Amplifikacija DNK, ki nas zanima, s pomočjo PCR.
3. Čiščenje izdelka PCR (DNK, ki nas zanima) z gel elektroforezo.
4. Odpiranje prejemniškega plazmida z enako restrikcijsko endonukleazo, ki se uporablja za ločevanje DNK, ki jih zanima matični plazmid.
5. Ligacija DNK, ki nas zanima (gen), v prejemni plazmid, da nastane subklonirani plazmid.
6. Preoblikovanje subkloniranega vektorja v kompetentno gostiteljsko bakterijo.
7. Pregled preoblikovanih celic.
8. Prečiščenje plazmidne DNA in uporaba za DNA sekvenciranje ali ekspresijo genov za pridobitev želenih produktov.

Subkloniranje se izvaja v primerih izolacije enega gena iz klonirane skupine genov ali kadar je gen, ki ga zanima, treba prenesti v uporaben plazmid, da bi videli natančno funkcijo gena, ki nas zanima.

Slika_02: Postopek subkloniranja

Kakšna je razlika med kloniranjem in subkloniranjem?

Kloniranje proti subkloniranju
Kloniranje je postopek, ki proizvaja gensko enake organizme ali celice.	Subkloniranje je postopek premika gena, ki nas zanima, z enega vektorja na drugega, da bi videli izražanje gena za pridobitev želene funkcionalnosti gena.
Proces
Organizem ločite DNK, ki vas zanima, in ga enkrat vstavite v vektor in klonirate	Že klonirano DNK ločimo od prvega vektorja in jo vstavimo v drugi vektor ter kloniramo.
Vstavite gibanje prek vektorjev
Ne premika vložkov (DNK, ki nas zanima) iz enega vektorja na drugega.	Premaknite vstavke iz nadrejenega v ciljni vektor.

Povzetek - Kloniranje proti subkloniranju

Kloniranje ustvarja genetsko identične celice ali organizme z vstavljenim genom ali DNK, ki vas zanima. Izvaja se z ločevanjem in vstavitvijo DNK, ki nas zanima, v vektor in ekspresijo v gostiteljski bakteriji. Subkloniranje ima podobne korake s kloniranjem. Vendar pa v subkloniranju že klonirani fragment DNK (zanimiv gen) vstavimo v vektor in ga spremenimo v gostiteljsko bakterijo. To je ključna razlika med kloniranjem in subkloniranjem.

Reference

1. Lodish, Harvey. "Kloniranje DNK s plazmidnimi vektorji." Molekularna celična biologija. 4. izdaja. Ameriška nacionalna medicinska knjižnica, 1. januarja 1970. Splet. 05. mar 2017
2. "Subkloniranje." Wikipedija. Wikimedia Foundation, 14. februar 2017. Splet. 06. mar 2017
3. "Subkloniranje." Subkloniranje | Članki z odprtim dostopom | Dnevniki z odprtim dostopom | Zbornik konference | Uredniki | Avtorji | Pregledniki | znanstveni dogodki. N.p., n.d. Splet. 06. mar 2017
4. Wackerhage, Henning. "Kako subklonirati." Kako subklonirati. N.p., 01. januarja 1970. Splet. 06. mar 2017

Vljudnost slik

1. Postopek molekularnega kloniranja - S CNX OpenStax [CC BY 4.0], prek Wikimedia Commons
2. Postopek subkloniranja - Prvotni nalagalnik je bil Takometer na angleški Wikipediji (prenesen iz en.wikipedia v Commons.) [CC BY 2.5], prek Wikimedia Commons