Razlika med varnejšim sekvenciranjem in pirosekvenco

Ključna razlika - nevarnejše zaporedje v primerjavi s piro sledi
 

Za zaporedje DNK je zelo pomembno sekvenciranje DNK, saj poznavanje pravilne razporeditve nukleotidov na določenem območju DNK razkrije veliko pomembnih informacij o njem. Obstajajo različne metode zaporedja DNK. Sanger sekvenciranje in pirokasting sta dve različni metodi sekvenciranja DNA, ki se široko uporabljata v molekularni biologiji. Ključna razlika med zaporedjem Sanger in Pyrosequences je v tem Sanger sekvenciranje uporablja dideoksinukleotide za prekinitev sinteze DNK za branje nukleotidnega zaporedja, medtem ko pirokvencioniranje zazna sproščanje pirofosfata z vključitvijo nukleotidov in sintetizacijo komplementarne sekvence za branje natančnega vrstnega reda zaporedja.

VSEBINA
1. Pregled in ključne razlike
2. Kaj je Sanger Sequiting
3. Kaj je pirotekanje
4. Primerjava ob strani - varnejše zaporedje proti pirotekanju
5. Povzetek

Kaj je Sanger Sequiting?

Sanger sekvenciranje je metoda prvega zaporedja DNK prve generacije, ki sta jo razvila Frederick Sanger in njegovi kolegiji leta 1977. Znana je tudi pod Zaporedje verižne prekinitve ali Dideoksi zaporedje saj temelji na prekinitvi verige z dideoksinukleotidi (ddNTP). Ta metoda se je široko uporabljala več kot 30 let, dokler ni bilo razvito zaporedje nove generacije (NGS). Sanger tehnika sekvenciranja je omogočila odkrivanje pravilnega nukleotidnega reda ali pritrditev določenega fragmenta DNK. Temelji na selektivni vključitvi ddNTP in prekinitvi sinteze DNK med in vitro Podvajanje DNK. Odsotnost 3 'OH skupin za nadaljevanje tvorbe fosfodiesterskih vezi med sosednjimi nukleotidi je edinstvena značilnost ddNTP. Torej, ko je DDNTP pritrjen, se raztezanje verige preneha in preneha od te točke. V Sangerjevem zaporedju se uporabljajo štirje DDNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP in ddTTP. Ti nukleotidi ustavijo proces podvajanja DNK, ko so vključeni v naraščajoči niz DNK in povzročijo različne dolžine kratke DNK. Kapilarna gel elektroforeza se uporablja za organizacijo teh kratkih pramenov DNK po velikosti gela, kot je prikazano na sliki 01.

Slika 1: Elektroforeza kapilare v sintetizirani kratki DNK

Za in vitro podvajanje DNK, je treba zagotoviti malo zahtev. To so encim DNA polimeraze, šablonska DNK, oligonukleotidni prajmerji in deoksinukleotidi (dNTP). V Sangerjevem sekvenciranju se replikacija DNA izvede v štirih ločenih epruvetah skupaj s štirimi vrstami ddNTP. Deoksinnukleotidi v celoti ne nadomestijo ustreznih ddNTP. Mešanica določenega dNTP (na primer; dATP + ddATP) je vključena v epruveto in posneta. Štirje ločeni cevni izdelki se nahajajo na gelu v štirih ločenih vdolbinicah. Nato z branjem gela lahko zaporedje zgradimo, kot je prikazano na sliki 02.

Slika 02: Sangerno zaporedje

Sanger sekvenciranje je pomembna tehnika, ki pomaga na številnih področjih molekularne biologije. Projekt človeškega genoma je bil uspešno zaključen s pomočjo metod, ki temeljijo na Sangerjevem zaporedju. Sangerno zaporedje je uporabno tudi pri določanju ciljne sekvence DNK, raziskavah raka in genetskih bolezni, analizi genske ekspresije, identifikaciji človeka, odkrivanju patogenov, sekvenciranju mikrobov itd..

Pri Sangerjevem zaporedju je več pomanjkljivosti:

• Dolžina sekvencirane DNK ne sme biti daljša od 1000 baznih parov
• Naenkrat je lahko zaporedje samo en pramen.
• Postopek je dolgotrajen in drag.

Zato so bile s časom za premagovanje teh težav razvite nove napredne tehnike zaporedja. Vendar je Sanger sekvenciranje še vedno v uporabi zaradi svojih zelo natančnih rezultatov do približno 850 fragmentov dolžine baznega para.

Kaj je pirotekanje?

Pirocesifikacija je nova tehnika zaporedja DNK, ki temelji na "sekvenciranju po sintezi". Ta tehnika se opira na odkrivanje sproščanja pirofosfata ob vgradnji nukleotida. V postopku sodelujejo štirje različni encimi: DNA polimeraza, ATP sulfurilaza, luciferaza in apiraza ter dva substrata adenozin 5 'fosfosulfata (APS) in luciferin.

Postopek se začne z vezanjem temeljnega premaza z enodročno šablono DNK in DNA polimeraza začne vključitev nukleotidov, ki se dopolnjujejo z njim. Ko se nukleotidi združijo (polimerizacija nukleinske kisline), sprošča skupine pirofosfata (dve fosfatni skupini, ki sta povezani) in energijo. Vsak dodatek nukleotidov sprosti ekvimolarno količino pirofosfata. Pirofosfat se v prisotnosti substrata APS pretvori v ATP s sulfurilazo ATP. Ustvarjen ATP poganja pretvorbo luciferine v oksiluciferin, posredovano z luciferazom, pri čemer nastaja vidna svetloba v količinah, sorazmernih količini ATP. Svetlobo zazna fotonska naprava ali fotomultiplikator in ustvari pirogram. Apiraza razgradi ATP in neinkorporirane dNTP v reakcijski mešanici. Dodajanje dNTP se izvede enkrat naenkrat. Ker je dodajanje nukleotida znano glede na vključitev in zaznavanje svetlobe, je mogoče določiti zaporedje predloge. Pirogram se uporablja za ustvarjanje nukleotidnega zaporedja vzorčne DNK, kot je prikazano na sliki 03.

Pirocesifikacija je zelo pomembna pri analizi nukleotidnega polimorfizma in sekvenciranju kratkih odsekov DNK. Visoka natančnost, fleksibilnost, enostavnost avtomatizacije in vzporedne obdelave so prednosti piro-sledenja pred Sangerjevimi sledilnimi tehnikami.

Slika 03: Piroaktivacija

Kakšna je razlika med Sanger Sequencing in Pyrosequences?

Sanger Sequiting vs Pyrosequences
Sanger sekvenciranje je metoda sekvenciranja DNA, ki temelji na selektivnem vključevanju ddNTPs z DNA polimerazo in verižnim prenehanjem.	Pirocesifikacija je metoda sekvenciranja DNA, ki temelji na odkrivanju sproščanja pirofosfata ob vgradnji nukleotida.
Uporaba DDNTP
Za zaključek podvajanja DNA se uporabljajo DDNTP-ji	ddNTP se ne uporabljajo.
Encimi vpleteni
Uporablja se DNK polimeraza.	Uporabljajo se štirje encimi: DNK polimeraza, ATP sulfurilaza, Luciferaza in Apiraza.
Uporabljeni substrati
APS in Luciferin se ne uporabljata.	Uporabljata se adenozin 5 'fosfosulfat (APS) in luciferin.
Najvišja temperatura
To je počasen proces.	To je hiter postopek.

Povzetek - Sanger Sequiting vs Pyrosequences

Sanger sekvenciranje in Pyrosequences sta dve metodi sekvenciranja DNA, ki se uporabljata v molekularni biologiji. Sanger sekvenciranje konstruira zaporedje nukleotidov v zaporedju s prekinitvijo raztezka verige, medtem ko pirokvencioniranje konstruira natančen vrstni red nukleotidov v zaporedju z vgradnjo nukleotidov in odkrivanjem sproščanja pirofosfatov. Zato je glavna razlika med Sangerjevim sekvenciranjem in Pyrosequences v tem, da Sanger sekvenciranje deluje na sekvenciranju s prekinitvijo verige, medtem ko piroknjiženje deluje na sekvenciranju s sintezo.

Referenca:
1. Fakruddin, Md, in Abhijit Chowdhury. "Pirotekanje - alternativa tradicionalnemu nevarnemu sekvenciranju." Ameriški časopis za biokemijo in biotehnologijo. Znanstvene publikacije, 02. mar 2012. 2012. Splet. 28. februar 2017.
2. "Varnejše zaporedje." Sangerno zaporedje - ScienceDirect Teme. N.p., n.d. Splet. 28. februar 2017

Vljudnost slik:
1. "Didesoxy-Metode" Christoph Goemans (modifiziert) - dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) prek Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-seq" avtorja Enzo na poljskem jeziku Wikipedia (CC BY-SA 3.0) prek Commons Wikimedia
3. "Piroaktivacija" z mikrobiobajti (CC BY-SA 2.0) prek Flickr