Razlika med Maxamom Gilbertom in Sanger Sequcking

Ključna razlika - Maxam Gilbert proti Sanger sekvenciranju
 

Nukleotidi so osnovne strukturne enote in gradniki DNK. Molekul DNA je sestavljen iz polinukleotidne verige. V DNK najdemo štiri različne nukleotide. Ti nukleotidi so sestavljeni iz štirih različnih dušikovih baz z imenom A (adenin), G (gvanin), C (citozin), T (timin). Vrstni red nukleotidov v molekuli DNK ima velik pomen, saj kodira pomembne genetske informacije za rast in razvoj organizmov. Sekvenciranje DNK se nanaša na postopek, ki določa natančno nukleotidno zaporedje DNK. Obstajajo različne metode zaporedja DNK. Maxam Gilbert sekvenciranje in Sanger sekvenciranje DNA sta dve metodi sekvenciranja DNA, ki spadata v sekvenco prve generacije. Postopek sekvenciranja Maxam Gilbert določa osnovno zaporedje s kemičnim cepljenjem prednostnih fragmentov 5 'konca DNA na vsakem od štirih nukleotidov in gel elektroforezi. Sanggerjev postopek sekvenciranja določa nukleotidno zaporedje s sintezo enoverižne DNA z uporabo DNA polimeraze in dideoksinukleotidov ter gel elektroforeze. To je ključna razlika med Maxamom Gilbertom in Sanger Sequencing.

VSEBINA
1. Pregled in ključne razlike
2. Kaj je Maxam Gilbert
3. Kaj je Sanger Sequiting
4. Primerjava ob strani - Maxam Gilbert proti Sanger Sequcking
5. Povzetek

Kaj je sekvenca Maxam Gilbert?

Maxam Gilbert zaporedje, znano tudi kot metoda kemičnega zaporedja, je tehnika, ki je bila razvita za določanje vrstnega reda nukleotidov v DNK. To metodo sta leta 1976 uvedla Walter Gilbert in Alan Maxam in postala priljubljena, saj jo je mogoče izvajati neposredno s prečiščeno DNK. Maxam Gilbert metoda spada v prvo generacijo sekvenciranja DNK in je bila prva metoda sekvenciranja, ki jo znanstveniki široko uporabljajo.

Osnovno načelo te metode je omejevanje končno označenih fragmentov DNK na specifičnih bazah s specifičnimi kemikalijami in pogoji ter ločevanje označenih fragmentov z elektroforezo, kot je prikazano na sliki 01. Fragmenti so ločeni glede na njihovo velikost na gel. Ker so fragmenti označeni, lahko zaporedje molekule DNK enostavno sklepamo.

Maxam gilbert metoda uporablja bazične kemikalije za razbijanje DNK na določene baze. Dve običajni kemikaliji, imenovani dimetil sulfat in hidrazinske kemikalije, se uporabljajo za selektivno napadanje purinov oziroma pirimidinov.

Metoda sekvenciranja Maxam Gilbert se izvede v več korakih, kot sledi.

1. Prečiščenje zaporedja DNK z uporabo restrikcijskih endonuklez
2. Označevanje koncev fragmentov DNK z dodajanjem radioaktivnih fosfatov
3. Čiščenje označenih fragmentov z neoznačenih fragmentov z gel elektroforezo
4. Ločevanje DNK na koncu v štiri epruvete in ločeno obdelamo z baznimi kemikalijami
5. Elektroforeza vsebine vsake epruvete v ločenih linijah na ločitvi gela in odlomkov glede na njihovo dolžino.
6. Odkrivanje drobcev z avtoradiografom.

Slika 01: Zaporedje Maxam Gilbert

Kaj je Sanger Sequiting?

Sanger Sequencing je metoda zaporedja, ki sta jo Frederick Sanger in njegovi sodelavci razvila leta 1977 za določitev osnovnega zaporedja danega fragmenta DNK. Znan je tudi kot veriženje zaključka verige ali Metoda dideoksi zaporedja. Ta metoda deluje na principu selektivne vključitve verižnih zaključnih dideoksinukleotidov (ddNTP), kot so ddGTP, ddCTP, ddATP in ddTTP z DNK polimerazo med sintezo enojne verige DNA, da se konča tvorba pramenov. Dideoksinukleotidi nimajo 3 'OH skupin za tvorbo fosfodiesterskih vezi s sosednjim nukleotidom. Zato se tvorba pramenov ustavi, ko je DDNTP med varnim zaporedjem vključen v novo tvorjen pramen.

Pri tej metodi izvedemo štiri ločene reakcije sinteze DNA (PCR) v štirih ločenih epruvetah z eno vrsto ddNTP. Za epruvete za PCR so na voljo tudi druge zahteve, vključno s prajmerji, dNTP, Taq polimerazo, specifičnimi pogoji itd. V štirih epruvetah s štirimi mešanicami se izvajajo štiri ločene reakcije. Po PCR reakcijah nastale fragmente DNA toplotno denaturiramo in ločimo z gel elektroforezo. Nato fragmente vizualiziramo z uporabo označenega (radioaktivnega ali fluorescentnega) temeljnega premaza ali dNTPs, kot je prikazano na sliki 02.

Slika 02: Zaščitno zaporedje

Kakšna je razlika med Maxamom Gilbertom in Sanger Sequencing?

Maxam Gilbert proti Sanger Sequisting
Maxam Gilbert sekvenciranje je prva tehnika, razvita za sekvenciranje DNK.	Po metodi sekvenciranja Maxam Gilbert je bila uvedena nevarnejša metoda sekvenciranja.
Uporaba
Ta metoda se redko uporablja.	Za sekvenciranje se rutinsko uporablja nevarno sekvenciranje.
Uporaba nevarnih kemikalij
Uporablja nevarne kemikalije.	Uporaba nevarnih kemikalij je v primerjavi z metodo Maxam Gilbert omejena.
Označevanje za zaznavanje
Ta metoda uporablja radioaktivni P32 za označevanje koncev fragmentov DNK.	Za boljše zaporedje se uporabljajo radioaktivno ali fluorescenčno označene DDNTP.

Povzetek - Maxam Gilbert proti Sanger Sequisting

Maxam Gilbert in Sanger sekvenciranje sta dve vrsti sekvenciranja DNK, ki spadata pod zaporedje DNK prve generacije. Maxam Gilbert sekvenciranje je prva metoda, uvedena za sekvenciranje DNK leta 1976, in se izvaja z lomljenjem končnih označenih fragmentov DNK s kemikalijami, specifičnimi za bazo. Zato je znano kot kemično sekvenciranje. Način varnejšega zaporedja je bil uveden leta 1977 in temelji na reakcijah zaključevanja verig, ki jih poganja ddNTP. Zaščitna metoda zaporedja, ki je bolj priljubljena kot metoda Maxam Gilbert zaradi številnih pomanjkljivosti metode Maxam Gilbert, kot so prekomerna poraba časa, uporaba nevarnih kemikalij itd. To je razlika med Maxam Gilbert in Sangerjevim zaporedjem.

Reference:
1.Maxam, A. M in Walter Gilbert. "Nova metoda za zaporedje DNK." Zbornik Nacionalne akademije znanosti. National Acad Sciences, 9. december 1976. Splet. 30. mar. 2017
2.Heather, James M. in Benjamin Chain. "Zaporedje sekvencerjev: Zgodovina sekvenciranja DNK." Genomika. Academic Press, januar 2016. Splet. 30. mar. 2017
3.Pareek, Chandra Shekhar, Rafal Smoczynski in Andrzej Tretyn. "Tehnologije ločevanja in zaporedja genomov." Časopis za uporabno genetiko. Springer-Verlag, november 2011. Splet. 30. mar. 2017

Vljudnost slik:
1. Več zaporedov "Maxam gilbert" v angleški Wikipediji (CC BY 3.0) prek Commons Wikimedia
2. "Sanger-sequiting" Estevezj - Lastno delo (CC BY-SA 3.0) prek Commons Wikimedia