Razlika med kloniranjem genov in PCR

Ključna razlika - Gene Cloning proti PCR
 

Sinteza mnogih kopij DNK iz določenega fragmenta DNK se imenuje amplifikacija DNA. Obstajata dva glavna procesa amplifikacije DNA, in sicer kloniranje genov in PCR. Ključna razlika med kloniranjem genov in PCR je, kloniranje genov proizvaja več kopij določenega gena in vivo z izgradnjo rekombinantne DNK in rastjo znotraj gostiteljske bakterije, medtem ko PCR ustvari milijone kopij določenega fragmenta DNK in vitro v ponavljajočih se ciklusih denaturacije in sinteze.

VSEBINA
1. Pregled in ključne razlike
2. Kaj je gensko kloniranje
3. Kaj je PCR
4. Primerjava ob strani - Gene Cloning proti PCR
5. Povzetek

Kaj je gensko kloniranje?

Kloniranje genov je tehnika, ki se uporablja za iskanje in množenje določenega gena iz ekstrahirane genomske DNK v organizmu s pomočjo gradnje rekombinantne DNK. Genomska DNK vsebuje na tisoče različnih genov, kodiranih za beljakovine. Ko DNK ekstrahiramo, vključuje vse možne gene, ki jih lahko nosi. Tehnika kloniranja genov je omogočila odkrivanje specifičnega gena iz celotne DNK. Zato je kloniranje genov pomembno orodje v molekularni biologiji.

Ustvarjanje genske knjižnice organizma je bistveno pri kloniranju genov, če v DNK ni pojma o lokaciji ustreznega gena. Genomska knjižnica je narejena po naslednjih korakih.

Korak 1: Ekstrakcija celotne DNK iz organizma, ki vsebuje želeni gen.

2. korak: Restriktivna prebava ekstrahirane DNK, da nastanejo majhni obvladljivi fragmenti. Ta korak je olajšan z restrikcijskimi endonukleazami.

3. korak: Izbor primernega vektorja in odpiranje vektorske DNA z uporabo enake restrikcijske endonukleze. Bakterijski plazmidi se običajno uporabljajo kot vektorji za prenašanje tuje DNK. Plazmidi so majhni krogi DNK, ki se nahajajo znotraj bakterij.

4. korak: Kombinacija vektorske DNK in fragmentirane DNK za nastanek rekombinantne molekule DNA. Ta korak ureja ligaza DNA.

5. korak: Prenos rekombinantnih molekul DNK v gostiteljske bakterije. Ta korak je znan kot preobrazba in se izvaja s pomočjo vročinskega udara.

5. korak: Pregled transformiranih bakterijskih celic na gojišču. Na koncu procesa transformacije dobimo mešano populacijo transformiranih in netransformiranih gostiteljskih celic. Ker zanimiv gen vključuje samo transformirane gostiteljske celice. Zato je treba izbrati transformirane celice. Izbor se izvede s pomočjo selektivnih medijev, ki vsebujejo antibiotike. Na tem presejalnem mediju rastejo le transformirane celice, ki omogočajo izbiro.

6. korak: Gojenje bakterij za proizvodnjo genske knjižnice. V tem koraku se transformirane gostiteljske celice vnesejo v svež medij za kulturo, kar zagotavlja optimalne potrebe po rasti. Skupne kolonije na kulturnih ploščah predstavljajo gensko knjižnico tega organizma.

7. korak: Molekul rekombinantne DNA, ki vsebuje zanimiv gen, je treba pregledati iz tisoč kloniranih fragmentov rekombinantne DNK. To lahko dosežemo z uporabo sond, ki označujejo določen gen ali specifične beljakovine, ki izhajajo iz tega gena.

Ko je zainteresiran gen, ki vsebuje bakterijsko kolonijo, identificiran iz celotnih kolonij, je mogoče narediti milijone kopij rekombinantnega plazmida, ki vsebuje gen.

Kloniranje genov se uporablja pri ustanavljanju genskih knjižnic, za proizvodnjo posebnih beljakovin, vitaminov, antibiotikov, hormonov, sekvenciranja in kartiranja genomov organizmov, pri čemer se naredi več kopij DNK posameznikov v forenziki itd..

Slika_1: Kloniranje genov

Kaj je PCR?

Verižna reakcija polimeraze (PCR) je tehnika, ki ustvari veliko število kopij določenega fragmenta DNA. Eksponentna amplifikacija določenega zaporedja DNK dobimo s PCR pod in vitro pogoji. Ta tehnika je zelo močno orodje v molekularni biologiji, saj lahko pomnoži majhen vzorec DNK v uporabno količino. PCR je leta 1983 uvedel Kary Mullis in ta nagradni izum je ustvaril velik napredek v molekularni biologiji.

Tehnika PCR sledi ponovljenim reakcijam PCR, kot je prikazano na sliki 02. Ena PCR reakcija je sestavljena iz treh glavnih korakov, ki se zgodijo pri treh različnih temperaturah; denaturiranje dvojnih verig pri DNK pri 94 ⁰C, žarjenje prajmov pri 68 ⁰C in raztezek pramena pri 72 ⁰C. Zato je treba pri pravilnem razmnoževanju pri vzdrževanju PCR močno vzdrževati nihanje temperature. PCR se izvaja v PCR napravi znotraj PCR cevi. Cevi za PCR so naložene s pravilnimi PCR mešanicami, ki vsebujejo šablonsko DNK, Taq polimerazo, primere, dNTP in pufer. Denaturiranje dvojno verižne vzorčne DNK v enojno verižno DNK se izvede z razbijanjem vodikovih vezi med komplementarnimi bazami pri 94 - 98 ⁰C. Potem so posamezni prameni šablonske DNK izpostavljeni osnovnim premazom. Zagotoviti je treba par temeljnih premazov (naprej in nazaj), termostabilne za prenašanje visokih temperatur. Primerji so enojne verige s kratkimi DNK, ki se dopolnjujejo do konca ciljnega fragmenta DNA. V PCR se uporabljajo sintetični osnovni premazi. Primeri se vežejo s komplementarnimi osnovami vzorčne DNK in začnejo sintezo novega sklopa. Ta korak katalizira encim, imenovan Taq polimeraza; termostabilni encim DNA polimeraza, izoliran iz Thermus auqaticus. Ko so na voljo primeri in nukleotidi (gradniki), Taq polimeraza tvori nov sklop DNK, ki dopolnjuje predlogo DNA. Na koncu programa PCR opazimo amplificiran fragment DNK z uporabo gel elektroforeze. Če je potrebna nadaljnja analiza, se PCR izdelek očisti iz gela.

PCR je zelo uporaben za diagnosticiranje in spremljanje genetskih in pridobljenih bolezni, identifikacijo kriminalcev (na področju forenzike), preučevanje strukture in funkcije ciljanega segmenta DNK, zaporedja in preslikave genomov organizmov itd. PCR je postal rutinska laboratorijska tehnika v znanstvenih laboratorijih za medicinsko in molekularno biologijo, saj ima široko paleto aplikacij.

Slika_2: Verižna reakcija polimeraze

Kakšna je razlika med genskim kloniranjem in PCR?

Gene Cloning proti PCR
Kloniranje genov je postopek izdelave več kopij določenega gena in vivo prek rekombinantne DNK in preoblikovanja v gostiteljsko bakterijo.	Tehnika PCR proizvaja več kopij določenega zaporedja DNK in vitro skozi ponavljajoče se cikle reakcij PCR.
Zahteva po konstrukciji rekombinantne DNA
Rekombinantna DNA nastaja z namenom lociranja gena.	Rekombinantna DNK se ne proizvaja.
Potreba po delovni sili
Ta postopek je delovno intenziven.	Intenzivna delovna sila ni potrebna.
In vivo ali in vitro postopek
Gradnja rekombinantne DNA je in vitro in amplifikacija DNK je in vivo.	Amplifikacija DNK se zgodi v celoti in vitro.

Povzetek - Gene Cloning vs PCR

Kloniranje genov in PCR sta dve metodi, ki se uporabljata za amplifikacijo DNA. PCR je an in vitro postopek, ki naredi več kopij DNK določenega fragmenta DNK brez uporabe rekombinantne DNK in gostiteljskega organizma. Kloniranje genov je predvsem an in vivo postopek, ki povzroči več kopij zainteresiranega gena v gostiteljskem organizmu z izgradnjo rekombinantne DNA. To je razlika med kloniranjem genov in PCR.

Referenca:
1. Griffiths, Anthony JF. "Kloniranje specifičnega gena." Sodobna genetska analiza. Ameriška nacionalna medicinska knjižnica, 1. januarja 1999. Splet. 22. februar 2017
2. "Verižna reakcija polimeraze (PCR)." Nacionalni center za informacije o biotehnologiji. Ameriška nacionalna medicinska knjižnica, n.d. Splet. 22. februar 2017

Vljudnost slik:
1. "Slika 17 01 06" avtorja CNX OpenStax - (CC BY 4.0) prek Commons Wikimedia
2. "PCR" Madprime - Lastno delo (CC BY-SA 3.0) prek Wikimedije Commons